Rápido y mancha

Ingeniería Biomédica de la Naturaleza (2023)Citar este artículo

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Un ensayo de placa (el método estándar de oro para medir la concentración de viriones líticos con capacidad de replicación) requiere tinción y, por lo general, más de 48 h de tiempo de ejecución. Aquí mostramos que las imágenes holográficas sin lentes y el aprendizaje profundo se pueden combinar para acelerar y automatizar el ensayo. El dispositivo de imágenes compacto captura información de fase sin etiquetas a una velocidad de aproximadamente 0,32 gigapíxeles por hora por pocillo, cubre un área de aproximadamente 30 × 30 mm2 y un rango dinámico de concentración de virus 10 veces mayor que los ensayos estándar, y cuantifica los infectados. área y el número de unidades formadoras de placa. Para el virus de la estomatitis vesicular, el ensayo de placa automatizado detectó los primeros eventos de lisis celular causados ​​por la replicación viral tan pronto como 5 h después de la incubación, y en menos de 20 h detectó unidades formadoras de placa en tasas superiores al 90 % al 100 %. especificidad. Además, redujo el tiempo de incubación del virus del herpes simple tipo 1 en aproximadamente 48 h y el del virus de la encefalomiocarditis en aproximadamente 20 h. El ensayo sin tinciones debería poder utilizarse en la investigación virológica, el desarrollo de vacunas y el diagnóstico clínico.

Las infecciones virales pueden afectar a millones de personas en todo el mundo a través de enfermedades infecciosas como la gripe, el virus de la inmunodeficiencia humana y el virus del papiloma humano1. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos estimaron que, desde 2010, el virus de la influenza ha provocado entre 16 y 53 millones de enfermedades, entre 0,2 y 1 millón de hospitalizaciones y entre 16.700 y 66.000 muertes solo en Estados Unidos2,3. Además, la pandemia de COVID-19, que ha causado más de 500 millones de infecciones y más de 6 millones de muertes en todo el mundo, ha supuesto una enorme carga para la salud pública y el desarrollo socioeconómico de muchos países4. Para ayudar a hacer frente a estos desafíos de salud global, es necesario desarrollar técnicas de cuantificación de virus precisas y de bajo costo para el diagnóstico clínico5, el desarrollo de vacunas6 y la producción de proteínas recombinantes7 o agentes antivirales8,9.

Desarrollado en 1952, el ensayo de placas fue el primer método para cuantificar las concentraciones de virus. El ensayo, desarrollado por Renato Dulbecco, permite determinar manualmente el número de unidades formadoras de placas (UFP) en una muestra determinada que contiene viriones líticos con capacidad de replicación10,11. Estas muestras se diluyen en serie y se añaden alícuotas de cada dilución a una placa de células cultivadas10. A medida que el virus infecta las células adyacentes y se propaga, se formará gradualmente una placa que un experto puede inspeccionar visualmente. Debido a su capacidad única de proporcionar la infectividad de las muestras virales de una manera rentable, el ensayo de placa sigue siendo el método estándar de oro para cuantificar las concentraciones de virus, a pesar de la existencia de otros métodos12,13,14,15,16,17 ,18,19, como los ensayos de formación focal de inmunofluorescencia14, la reacción en cadena de la polimerasa16 y los ensayos basados ​​en inmunoensayos ligados a enzimas19,20. Sin embargo, los ensayos de placas generalmente necesitan un período de incubación de 2 a 14 días (según el tipo de virus y las condiciones de cultivo)21 para permitir que las placas se expandan a tamaños visibles y están sujetos a errores humanos durante el proceso de recuento manual de placas22. Para mejorar los ensayos de placa tradicionales se han desarrollado numerosos métodos23. Aunque muchos sistemas tienen capacidades únicas para obtener imágenes de cultivos celulares en placas de pocillos, requieren marcadores de fluorescencia22 o placas de cultivo especiales con microelectrodos de oro24. Además, los errores humanos de conteo siguen siendo un problema para estos métodos. Por tanto, un ensayo de placa preciso, cuantitativo, automatizado, rápido y rentable sería ventajoso para la investigación virológica y aplicaciones clínicas relacionadas.

Algunos de los avances recientes en imágenes de fase cuantitativa (QPI), holografía y aprendizaje profundo brindan una oportunidad para abordar esta necesidad. QPI es una técnica de imagen destacada que permite la visualización y cuantificación de muestras biológicas transparentes de forma no invasiva y sin etiquetas25,26. Además, la calidad de la imagen de los sistemas QPI se puede mejorar utilizando redes neuronales mejorando, en particular, la recuperación de fase27, la reducción de ruido28, el enfoque automático29,30 y la resolución espacial31. Además, se han demostrado numerosos métodos de detección e identificación de microorganismos basados ​​en el aprendizaje profundo utilizando QPI32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42.

Aquí presentamos un ensayo de placa viva sin etiquetas, compacto y rentable que puede proporcionar automáticamente una lectura cuantitativa de PFU sustancialmente más rápida que los ensayos de placa viral tradicionales sin necesidad de tinción. Construimos un prototipo de imagen holográfica compacto sin lentes (Fig. 1 y video complementario 1) para obtener imágenes de las características espaciotemporales de las UFP objetivo durante su incubación; El costo total de las piezas de todo este sistema de imágenes es inferior a 880 dólares estadounidenses, sin incluir una computadora portátil estándar. Este sistema de imágenes holográficas sin lentes escanea rápidamente toda el área de una placa de seis pocillos cada hora (a un rendimiento de ~0,32 gigapíxeles por escaneo de un pocillo de prueba) y las imágenes de fase reconstruidas de la muestra se utilizan para la detección de PFU basada en sobre los cambios espaciotemporales observados dentro de los pozos. Luego entrenamos un clasificador basado en redes neuronales y lo usamos para convertir las imágenes de fase reconstruidas en mapas de probabilidad de PFU, que luego se usaron para revelar las ubicaciones y tamaños de las PFU dentro de la placa del pozo. Para demostrar la eficacia de nuestro sistema, lo probamos para la detección temprana del virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) y el virus de la encefalomiocarditis (EMCV) en placas de células Vero E6. Nuestro dispositivo sin tinciones podría detectar automáticamente los primeros eventos de lisis celular debido a la replicación del VSV tan pronto como 5 h después de la incubación y lograr una tasa de detección de UFP >90 % en <20 h, lo que proporciona un importante ahorro de tiempo en comparación con los ensayos de placa tradicionales. , que tardan ≥48 h. Además, mostramos un ahorro de tiempo de incubación promedio de ~48 h y ~20 h para HSV-1 y EMCV, respectivamente, logrando una tasa de detección de UFP >90 % con 100 % de especificidad. También se desarrolló una relación cuantitativa entre la concentración del virus incubado y el área infectada por el virus en la monocapa celular. Sin ningún paso adicional de preparación de muestras, este dispositivo de cuantificación y obtención de imágenes de PFU sin etiquetas y con aprendizaje profundo se puede utilizar con varios ensayos de placa en virología y podría ayudar a acelerar la investigación en el desarrollo de vacunas y fármacos.

a, Fotografía del sistema de imágenes PFU sin manchas que captura las imágenes de fase del ensayo de placa con un rendimiento de ~0,32 gigapíxeles por escaneo de cada pocillo de prueba. El procesamiento de cada pozo de prueba utilizando la red clasificadora de PFU demora aproximadamente 7,5 minutos por pozo, lo que convierte automáticamente las imágenes de la fase holográfica del pozo en un mapa de probabilidad de PFU (Fig. 2). b, Ilustración detallada de los componentes del sistema. c, Una muestra de placa de seis pocillos con orificios de ventilación en la cubierta y parafilm sellado desde el lateral. Consulte también el vídeo complementario 1.

Para demostrar la eficacia del dispositivo, preparamos 14 ensayos de placa utilizando células Vero E6 y VSV. Los pasos de preparación de la muestra siguieron ensayos de placa estándar y se resumen en la Fig. 2a (consulte Métodos para obtener más detalles). Para cada placa de seis pocillos, se sembraron aproximadamente 6,5 × 105 células en cada pocillo, que luego se incubaron dentro de una incubadora (Heracell VIOS 160i CO2 Incubator, Thermo Scientific) durante 24 h para lograr una monocapa celular con >95% de cobertura. Durante la infección por el virus, se infectaron cinco pocillos con 100 µl de la suspensión de VSV diluida (obtenida diluyendo una solución madre de VSV de 6,6 × 108 PFU ml-1 con un factor de dilución de 2-1 × 10-6), y se dejó un pocillo. para control negativo. Luego, se agregaron a cada pocillo 2,5 ml de la solución de superposición que contenía el medio total con agarosa al 4% (consulte Métodos para obtener más detalles, 'Preparación de la solución de superposición de agarosa'). Después de la solidificación de la superposición a temperatura ambiente, cada muestra se colocó primero en nuestra configuración de imágenes durante 20 h de incubación, realizando imágenes de lapso de tiempo para capturar la información espaciotemporal de la muestra. Luego, la misma muestra se dejó en la incubadora durante 28 h adicionales para permitir que las UFP crecieran hasta su tamaño óptimo para el ensayo de placa tradicional (esto solo se usa con fines de comparación). Finalmente, cada muestra se tiñó con una solución de cristal violeta para que sirviera como base para compararla con nuestro método sin etiquetas.

a, Flujo de trabajo de preparación de muestras de ensayo de placa. El ensayo de placa tradicional en el último paso sólo se realiza con fines comparativos y no es necesario para el funcionamiento del dispositivo de detección de UFP presentado. b – f, Imagen detallada y pasos de procesamiento de datos para el ensayo de placa viral viva. b, Un paso de preprocesamiento de imágenes que reconstruye y registra los hologramas consecutivos de todo el pocillo. Se utiliza un clasificador de PFU basado en una red neuronal en forma de escaneo para convertir los hologramas en un mapa de probabilidad de PFU. c, Un ejemplo del procesamiento de red en una región local. d, Un ejemplo de un mapa de probabilidad de PFU de un solo pozo. e, después de usar un umbral de 0,5, el mapa de probabilidad de PFU en d se convierte en el resultado de la detección de PFU. f, Un ejemplo de un resultado de detección de PFU en placa completa de seis pocillos.

Para entrenar y probar el clasificador VSV PFU basado en red, se usaron 54 pozos (es decir, 45 pozos positivos y 9 pozos negativos) para el entrenamiento y 30 pozos (es decir, 25 pozos positivos y 5 pozos negativos) para las pruebas. . Durante la fase de capacitación, se desarrolló un algoritmo de localización aproximada de PFU basado en aprendizaje automático para acelerar la generación del conjunto de datos de capacitación y delinear los posibles falsos positivos (consulte Métodos para obtener más detalles). Después de que este algoritmo de localización de PFU examinó cada muestra, los candidatos a PFU resultantes se examinaron manualmente para su confirmación utilizando una interfaz gráfica de usuario desarrollada a medida (Figura 1 complementaria); Este examen manual solo se utilizó durante la fase de entrenamiento para preparar los datos de entrenamiento de manera correcta y eficiente. El conjunto de datos de entrenamiento negativo se completó exclusivamente a partir del pocillo de control negativo de cada placa de pocillos. En total, se recopilaron 357 videos holográficos de PFU positivos verdaderos y 1169 videos holográficos negativos para entrenar la red neuronal de decisión de PFU. Este conjunto de datos se amplió aún más para crear un total de 2594 videos holográficos positivos y 3028 negativos (métodos), donde cada cuadro tenía 480 × 480 píxeles y el intervalo de tiempo entre dos cuadros holográficos consecutivos fue de 1 h.

Después de entrenar el clasificador VSV PFU basado en redes neuronales, se probó a ciegas en los 30 pocillos de prueba mediante escaneo (Fig. 2b) sin la necesidad del algoritmo de localización PFU, que solo se usó para la generación de datos de entrenamiento. Para cada pozo de prueba, tenemos ~18 000 × 18 000 píxeles efectivos (que representan un área activa de 30 × 30 mm2 después de descartar los bordes); el procesamiento digital de cada pozo de prueba utilizando la red clasificadora de PFU (Fig. 2c) toma aproximadamente 7,5 minutos, lo que convierte automáticamente las imágenes de la fase holográfica del pozo en un mapa de probabilidad de PFU (Fig. 2d). Cada píxel del pozo en este mapa indica la probabilidad estadística de que el área local (0,8 × 0,8 mm2) centrada en este píxel tenga una PFU. Utilizando un umbral de probabilidad de 0,5, el resultado final de detección y cuantificación de PFU se obtuvo en toda el área del pozo de prueba (por ejemplo, Fig. 2e, f). El impacto de este umbral de probabilidad se analiza y analiza en la figura complementaria 2 y la nota complementaria 1, que ilustran el equilibrio entre la especificidad y la sensibilidad al seleccionar diferentes valores de umbral.

La Figura 3a muestra ejemplos del rendimiento del dispositivo en la detección de UFP de VSV después de 17 h de incubación, lo que representa un momento crítico en el que la tasa de detección supera el 90 % (la Figura complementaria 3 también muestra nuestros resultados de detección después de 15 h y 20 h de incubación, informados para comparación). También se seleccionan y muestran tres PFU representativas en la Fig. 3b. Cuando una PFU se encuentra en su etapa inicial de crecimiento, con un tamaño mucho más pequeño que nuestra ventana de escaneo virtual de 0,8 × 0,8 mm2, aparece como un cuadrado (mostrado por PFU1 en la Fig. 3b) en el resultado de detección final, que efectivamente es el Convolución espacial bidimensional (2D) de la PFU de pequeña escala con nuestra ventana de escaneo. Como otro ejemplo, PFU3 muestra un evento de formación de grupos en el que dos PFU vecinas se pueden diferenciar fácilmente utilizando nuestro método, a diferencia del ensayo de placa tradicional en el que se fusionan físicamente en uno. La Figura 3c muestra además la cuantificación de UFP lograda por nuestro dispositivo en comparación con los resultados del ensayo de placa tradicional de 48 h. Logramos una tasa de detección de> 90% a las 20 h de incubación sin tener falsos positivos en ningún momento a pesar de no utilizar tinción.

a, Comparación de pocillos completos del ensayo de placa viral sin tinción después de 17 h de incubación con el ensayo de placa tradicional después de 48 h de incubación y tinción. b, El crecimiento de tres UFP destacadas en el pozo positivo de a. El canal de fase reconstruido se superpone con la máscara generada utilizando el algoritmo de localización PFU para revelar mejor sus ubicaciones. c, Tasa promedio de detección de UFP utilizando el ensayo de placa viral sin etiqueta. Las barras de error muestran la desviación estándar entre las cinco placas de prueba.

También comparamos nuestros resultados con un sistema de conteo automático de UFP ampliamente adoptado que está disponible comercialmente. Después de la incubación de 48 h, seguida del protocolo de tinción estándar, tomamos imágenes de las mismas cinco placas de prueba de seis pocillos (VSV, Fig. 3c) utilizando esta vez el dispositivo Agilent BioTek Cytation 5 (Agilent Technologies). Después de la adquisición automatizada de imágenes con este sistema, la detección de PFU se realizó mediante el software Gen 5 (Agilent Technologies) utilizando la configuración optimizada de su algoritmo de conteo automatizado de PFU (Métodos). Se logró una tasa de detección del 94,3% con una tasa de descubrimiento falso del 1,2%. En comparación, el método holográfico sin manchas presentado logró una tasa de detección de UFP del 93,7 % con una tasa de descubrimiento falso del 0 % a las 20 h de incubación para las mismas muestras (es decir, 28 h antes en comparación con el tiempo de incubación estándar). Además de omitir algunas de las UFP de crecimiento tardío e introducir algunos falsos positivos, este sistema automatizado de recuento de UFP disponible comercialmente también mostró una sobresegmentación en UFP grandes y una subdetección de UFP para muestras con altas concentraciones de virus. En la figura complementaria 4 se muestra un informe detallado de las PFU contadas en exceso, falsas negativas y falsas positivas y un resumen visualizado del rendimiento de la detección de PFU de este método de detección estándar en comparación con nuestro dispositivo.

Además de ahorrar tiempo de incubación y no tener manchas, nuestro marco presentado también muestra una fuerte capacidad de generalización. Por ejemplo, después de su entrenamiento con placas de seis pocillos, se puede utilizar directamente en placas de 12 pocillos sin necesidad de realizar modificaciones ni pasos de reentrenamiento (consulte 'Preparación de la placa de pocillos'). Sin ningún paso de aprendizaje por transferencia, logramos una tasa de detección de UFP del 89 % a las 20 h de incubación (VSV) cuando se probó a ciegas en una placa de 12 pocillos (Figura complementaria 5). Además, nuestro dispositivo de detección computacional de PFU puede generalizarse para detectar otros tipos de virus (por ejemplo, HSV-1 y EMCV) mediante el aprendizaje por transferencia mientras utiliza la red de detección de VSV PFU como modelo base. Para HSV-1, se prepararon dos placas de seis pocillos para el aprendizaje por transferencia (Métodos), se tomaron imágenes durante 72 h con un intervalo y período de imágenes de 2 h, y se incubaron adicionalmente durante un total de 120 h para obtener las muestras de PFU teñidas. . Los datos recopilados se utilizaron para completar el conjunto de datos de capacitación para el aprendizaje por transferencia. La red neuronal HSV-1 resultante se probó a ciegas en 12 pocillos de prueba HSV-1 adicionales (que contienen, en total, 214 UFP de HSV-1 y dos pocillos de control negativo); Como se muestra en la figura complementaria 6, sin introducir falsos positivos, nuestro marco logró una tasa de detección del 90,4 % a las 72 h, lo que redujo 48 h de tiempo de incubación en comparación con las 120 h requeridas por el ensayo de placa tradicional de HSV-143. De manera similar, para EMCV se utilizaron tres placas de seis pocillos para el aprendizaje por transferencia ("preparación de placas de pocillos"), de las que se tomaron imágenes durante 60 h con un intervalo de imágenes de 1 h y se tiñeron a las 72 h de incubación total, siguiendo los protocolos estándar. Cuando se realizó la prueba en 12 pocillos de prueba de EMCV adicionales (que contienen, en total, 249 PFU de EMCV y dos pocillos de control negativo), se obtuvo una tasa de detección del 90,8 % con un 0 % de falsos positivos a las 52 h de incubación, como se muestra en la figura complementaria 7. , logrando un ahorro de tiempo de incubación de 20 h en comparación con el tiempo real de 72 h para el ensayo de placa de EMCV tradicional44. En particular, las placas EMCV contienen muchas más UFP de crecimiento tardío en comparación con VSV o HSV-1, lo que también concuerda con observaciones anteriores45. El marco presentado logró un rendimiento confiable en el recuento de placas de EMCV incluso para las regiones de fusión de PFU de un pozo de prueba, como se ilustra en la Figura complementaria 7c. Debido a la capacidad de detección temprana basada en el análisis de características espaciotemporales del sistema sin manchas, podría identificar cada PFU individual dentro de estas regiones de PFU fusionadas en las primeras fases del crecimiento de la placa, eliminando falsos negativos o errores que podrían haber surgido en las PFU estándar. métodos de conteo debido a la expansión de UFP anteriores, cubriendo espacialmente (y oscureciendo) las placas de crecimiento tardío.

El dispositivo presentado es rentable, compacto y automatizado y también puede manejar un rango de concentración de virus más amplio con una lectura de PFU más confiable. Para demostrar esto, preparamos otro conjunto de placas de prueba de cinco títulos, donde para cada placa, los seis pocillos estaban infectados por VSV pero con una diferencia de dilución dos veces mayor entre cada pocillo, cubriendo un amplio rango dinámico en la concentración de virus de una prueba. bueno a otro. Como se muestra en la Fig. 4, nuestro método es eficaz incluso para los casos de mayor concentración de virus; véanse, por ejemplo, los casos de dilución de 2−2 × 10−4 y 2−3 × 10−4. En el ensayo de placa tradicional de 48 h, solo la concentración de virus más baja es adecuada para la cuantificación de UFP debido a una superposición espacial severa, mientras que para nuestro dispositivo sin etiquetas, podemos contar de forma automática y precisa las UFP individuales en una etapa temprana, incluso para el mayor concentración de virus (Fig. 4c).

a,b, Comparación de la placa completa del ensayo de placa viral sin tinción después de 15 h de incubación (a) con el ensayo de placa tradicional después de 48 h de incubación y tinción (b). c, El crecimiento de UFP en su etapa inicial para la misma placa que se muestra en a y b.

Además, nuestro método proporciona una lectura más confiable; por ejemplo, en la región rodeada por un círculo en la Fig. 4a, b, la ausencia de células fue causada por algunos problemas aleatorios de viabilidad celular que ocurrieron durante el ensayo de placa. En nuestro dispositivo, estos artefactos se pueden diferenciar fácilmente de los eventos de lisis celular causados ​​por la replicación viral, ya que los patrones espaciotemporales para estos dos eventos son muy diferentes (evaluados por la red de probabilidad de PFU entrenada). Esto hace que el dispositivo habilitado para aprendizaje profundo sea resistente a posibles artefactos o problemas de viabilidad celular introducidos aleatoriamente durante los pasos de preparación de la muestra.

Debido a la alta concentración de virus utilizada en estas muestras de prueba de cinco títulos, las UFP se agruparon rápidamente y ya no eran adecuadas para el recuento manual, como se muestra en la Fig. 5a. Sin embargo, la lectura cuantitativa y el mapa de probabilidad de PFU del dispositivo nos permitieron obtener el área de las regiones infectadas por el virus en todos los puntos temporales durante el período de incubación, como se muestra en la Fig. 5b. Para ilustrar mejor esto, en la Fig. 5c trazamos el factor de dilución del virus versus la proporción del área de células infectadas por pocillo de prueba (en%) para todas las muestras a las 6 h, 8 h y 10 h de tiempo de incubación. A pesar de la existencia de algunos errores de dilución en serie, despertares tardíos del virus y eventos de agrupación de UFP, el porcentaje de área infectada que midió el dispositivo disminuye monótonamente con el aumento del factor de dilución durante todos los tiempos de incubación. Esto sugiere que, al calibrar el sistema, la concentración de virus (PFU ml-1) también se puede estimar a partir del porcentaje del área de células infectadas por pocillo.

a, Resultados del recuento de UFP para diferentes muestras de virus de alta concentración en diferentes momentos. La región de color rojo claro indica el momento en que las UFP estaban muy agrupadas y ya no eran aptas para contar. b, Área de las regiones infectadas por virus para diferentes muestras de alta concentración de virus en diferentes momentos. Los puntos de datos en a y b muestran los valores medios en placas de prueba de cinco títulos. Las barras de error en a y b muestran el error estándar en placas de prueba de cinco títulos. c, Gráficos del factor de dilución del virus versus la proporción del área de células infectadas por pocillo de prueba (en %) para todas las muestras de prueba de cinco títulos a las 6 h, 8 h y 10 h de tiempo de incubación.

Además, al utilizar el porcentaje de área de la región infectada por el virus como métrica de cuantificación sin etiquetas, el marco presentado puede proporcionar lecturas de PFU más tempranas. Para mostrar esto, calculamos el porcentaje de área infectada para los 25 pocillos positivos o infectados de las placas de prueba ciegas utilizadas para generar la Fig. 3c. Como se muestra en la Fig. 6, cuando el porcentaje de área infectada es suficientemente grande (>1%), se puede proporcionar una lectura más rápida de la concentración de PFU a las 12 h o 15 h. Como el tamaño de una PFU promedio en el pozo es físicamente mayor a las 15 h de incubación en comparación con las 12 h, la pendiente de la curva de calibración roja en la Fig. 6b es menor que en la Fig. 6a, como se esperaba. Para muestras con concentraciones de virus aún más altas, el porcentaje de área de células infectadas podría alcanzar> 1% en ≤10 h de incubación (como se muestra en la Fig. 5c), lo que proporciona una lectura de la concentración de PFU incluso antes.

a,b, Porcentaje de área infectada a las 12 h (a) y a las 15 h (b). Las concentraciones de virus en el eje y se obtuvieron del ensayo de placa tradicional de 48 h para cada pocillo de prueba. Se marcaron diferentes pocillos de prueba de la misma placa con el mismo color y símbolos. Hay 25 pocillos de prueba infectados en cada parcela. Las curvas de calibración rojas se obtuvieron mediante ajuste polinomial cuadrático.

Hemos mostrado un sistema de detección temprana de UFP automatizado y rentable que utiliza un sistema de imágenes holográficas sin lentes y aprendizaje profundo. Este dispositivo sin manchas basado en aprendizaje profundo captura imágenes de fase de lapso de tiempo de un pozo de prueba con un rendimiento de ~0,32 gigapíxeles por escaneo, que luego es procesada por una red neuronal de cuantificación de PFU en ~7,5 minutos para producir la distribución de PFU. de cada prueba bien. La alta tasa de detección de este dispositivo sin etiquetas con 100% de especificidad que se muestra en la Fig. 3c es una estimación conservadora, porque los datos reales se obtuvieron después de 48 h de incubación. En las primeras etapas del período de incubación, muchas UFP de VSV ni siquiera existían físicamente, lo que llevó a una subdetección (una tasa de detección del 80,1 % y 90,3 % a las 15 h y 17 h de incubación, respectivamente). Esto significa que si utilizáramos las PFU existentes como base para la cuantificación en cada momento, la tasa de detección sería aún mayor.

El núcleo del sistema de detección de PFU sin manchas radica en la combinación eficaz de holografía digital y aprendizaje profundo. La adopción del sistema de imágenes holográficas sin lentes es esencial para obtener imágenes de células no teñidas dentro de una incubadora compacta, proporcionando la información de la fase espaciotemporal de las muestras utilizando un sistema de imágenes compacto, rentable y de alto rendimiento. Para una marca de tiempo determinada del sistema de imágenes, las regiones PFU expresarían en general una distribución de fase más amplia en comparación con las regiones que no son PFU; además, una región PFU determinada normalmente mostraría cambios de fase más grandes en diferentes puntos de tiempo (consulte la Figura 8 complementaria para ver algunos ejemplos). Estas firmas espaciotemporales únicas que están presentes en el canal de fase de las imágenes holográficas de lapso de tiempo sin etiquetas son cruciales para que la red neuronal profunda identifique estadísticamente las regiones PFU objetivo de las regiones que no son PFU en puntos de tiempo anteriores, sin introducir falsos positivos o subconteo debido a superposiciones espaciales. Además, el gran campo de visión (FOV) de la configuración de imágenes holográficas en chip sin lentes con aumento de franja unitaria, junto con su capacidad de enfoque digital sin ningún hardware de enfoque automático ni lente objetivo, nos ayudó a lograr un gran rendimiento de información de fase. de ~0,32 gigapíxeles en <30 s por pocillo de prueba (que cubre un campo de visión de ~30 × 30 mm2) utilizando un dispositivo compacto y rentable que puede caber en cualquier incubadora estándar sin modificaciones importantes. Esto nos permitió escanear rápidamente una placa completa de seis pocillos en 3 minutos y, como resultado, el dispositivo puede escanear las muestras de PFU incluso con más frecuencia que cada hora, lo que podría permitir un mayor ahorro de tiempo en la detección de PFU utilizando cambios espaciotemporales más finos que podría aprenderse con un período de imágenes más corto. Este enfoque conllevaría la desventaja de requerir sustancialmente más datos de entrenamiento y tiempo de cálculo.

Además, debido a la tolerancia al desenfoque axial del método de detección de PFU basado en aprendizaje profundo, los pasos de reconstrucción de imágenes (que abarcan varias horas de imágenes automáticas en intervalos de tiempo dentro de una incubadora) se pueden simplificar aún más mediante la propagación de los hologramas sin lentes adquiridos. a una distancia axial fija entre la muestra y el sensor para todo el pozo sin afectar los resultados de detección de PFU, al mismo tiempo que se garantiza un alto rendimiento (la Nota complementaria 3 y la Fig. 9 complementaria muestran la tolerancia de distancia de desenfoque de nuestro sistema).

Además, el dispositivo de detección holográfica computacional de PFU requiere cambios insignificantes en los pasos estándar de preparación de muestras utilizados en los ensayos de placa tradicionales, al tiempo que omite por completo el proceso de tinción. La temperatura, el índice de refracción y los cambios del campo óptico dentro de la incubadora, causados, por ejemplo, por la evaporación o la formación de burbujas, tienen una influencia insignificante en el rendimiento de detección de PFU de este sistema, porque dichos artefactos y variaciones estadísticas se aprenden durante los experimentos de entrenamiento. ayudando a las redes neuronales entrenadas a diferenciar las características espaciotemporales de las verdaderas UFP correspondientes a la replicación viral de tales fluctuaciones y perturbaciones físicas dentro del entorno de la incubadora que ocurren naturalmente durante varias horas. Además, el sistema de imágenes holográficas de lapso de tiempo no influye negativamente ni introduce un sesgo en el proceso de formación de placa dentro de los pocillos de prueba, lo cual se valida frente a experimentos de control, como se muestra en la Figura complementaria 10.

El diseño modular utilizado por el sistema de detección de PFU tiene potencial para futuras mejoras del sistema. Por ejemplo, se pueden lograr imágenes en paralelo instalando varios sensores de imagen en el mismo sistema sin aumentar sustancialmente el costo del dispositivo, lo que mejorará aún más su rendimiento efectivo de imágenes de 30 cm2 min-146. Las etapas de escaneo más precisas también pueden ayudar a reducir los pasos de registro de imágenes necesarios durante el preprocesamiento de imágenes. También se puede implementar la recuperación de fase de múltiples longitudes de onda47 para mejorar la calidad general de la imagen de las placas sin etiquetas. El marco de detección de PFU habilitado para aprendizaje profundo se puede adaptar potencialmente a otras modalidades de imágenes que pueden usarse para medir diferencias espaciotemporales en las regiones de PFU para varios tipos de virus; De manera similar, la red clasificadora de PFU entrenada también tiene adaptabilidad a estos cambios del sistema (Nota complementaria 2).

En resumen, hemos demostrado el rendimiento de un ensayo de placa viral cuantitativo, rápido y sin tinciones que aprovecha el aprendizaje profundo y la holografía. El dispositivo compacto y rentable conserva todas las ventajas de los ensayos de placa tradicionales al tiempo que reduce sustancialmente el tiempo de incubación de la muestra requerido sin etiquetas, ahorrando tiempo y eliminando la necesidad de tinción. También es resistente a posibles artefactos durante la preparación de la muestra y puede cuantificar automáticamente un rango dinámico más amplio de concentraciones de virus por pocillo. Esperamos que esta técnica se utilice ampliamente en la investigación de virología, el desarrollo de vacunas y aplicaciones clínicas relacionadas.

Manejamos todos los cultivos celulares y virus durante nuestros experimentos en nuestro laboratorio de nivel 2 de bioseguridad de acuerdo con las normas y regulaciones ambientales, de salud y seguridad de la Universidad de California, Los Ángeles. Todas las operaciones se llevaron a cabo bajo estrictas condiciones asépticas.

Usamos Vero C1008 (Vero 76, clon E6, Vero E6) (ATCC CRL-1586) (American Type Culture Collection (ATCC)), VSV (ATCC VR-1238), HSV-1 (ATCC VR-260) y EMCV ( ATCC VR-129B). Las células Vero E6 son células de riñón de mono verde africano y son células epiteliales.

Colocamos el cultivo madre congelado inmediatamente en el vapor de nitrógeno líquido, hasta que esté listo para su uso, justo después de la entrega del cultivo madre congelado de la ATCC. Se utilizó el medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) formulado por ATCC (número de producto 30-2003, ATCC) como medio base para la línea celular. Para el medio de crecimiento completo, el medio base se mezcló con suero fetal bovino (FBS) (número de producto 30-2021, ATCC) con una concentración final del 10 %. La solución madre de FBS se distribuyó en alícuotas en tubos de microcentrífuga de 4 ml y se almacenó a -20 °C hasta su uso.

Utilizamos matraces de cultivo de tejidos (área de 75 cm2, tapa ventilada, tratado con cultivo de tejidos, T-75) (número de producto FB012937, Fisher Scientific) para el cultivo celular. El medio base en un matraz T-75 y FBS se llevaron a 37 °C en la incubadora (número de producto 51030400, ThermoFisher Scientific) y se alimentaron con CO2 al 5 % antes de manipularlo para los pasos de cultivo celular. Se preparó el medio de crecimiento completo. El cultivo celular congelado se retiró del nitrógeno líquido y se descongeló con agua corriente. Después de descongelar las células, la suspensión celular se añadió a un matraz T-75 que contenía 8 ml de medio de crecimiento completo (es decir, EMEM + FBS al 10%). El matraz se incubó a 37 °C y 5% de CO2 en la incubadora. La adherencia de las células a la superficie del matraz se analizó diariamente bajo un microscopio de contraste de fases. El medio del matraz se renovó dos o tres veces por semana. Las células se subcultivaron en una proporción de 1:4 cuando se alcanzó el 95% de confluencia de las células como monocapa.

Después de retirar el medio del matraz de cultivo celular, las células se expusieron a 2–3 ml de tripsina al 0,25%/EDTA 0,53 mM (ATCC 30-2101, ATCC) por matraz para la disociación de las monocapas celulares. Los matraces se mantuvieron en la incubadora durante 5 a 6 minutos para una rápida disociación de las células. Se agregaron aproximadamente 8 ml de medio completo a cada matraz y se transfirieron 2 a 3 ml de la mezcla que contenía células suspendidas a un nuevo matraz T-75. Se agregaron aproximadamente 8 ml de medio completo al nuevo matraz y, después de mezclarlo suavemente, se incubó a 37 °C y 5 % de CO2 para el crecimiento de nuevas células.

Después de la entrega de las muestras de virus de la ATCC, se almacenaron en tanques de nitrógeno líquido hasta su uso posterior. La propagación del virus requiere que se cultiven células Vero y que alcancen una confluencia del 90 al 95% el día de la infección. Por lo tanto, las células Vero se cultivaron durante 1 a 2 días antes de la propagación del virus utilizando una suspensión de células semilla de células Vero que se subcultivaron más de tres veces.

El día de la infección por el virus, se retiró y descartó el medio de crecimiento en el matraz de cultivo de células Vero. Luego, se enjuagó usando 5 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS), 1x (ATCC 30-2200) (número de producto 30-2200, ATCC). Después de mantener el matraz que contenía D-PBS durante 3 minutos en el gabinete, se retiró y descartó la solución tampón. Para la propagación del virus, las células Vero en cada matraz se infectaron con 14 µl de virus madre VSV, 17 µl de virus madre HSV-1 o 20 µl de virus madre EMCV con una multiplicidad de infección de 0,003, 0,07 y 0,05 para el VSV. , HSV-1 y EMCV, respectivamente. Después de esto, se añadieron a cada matraz 6 ml de EMEM (sin FBS). Los matraces se incubaron a 37 °C durante 1 h y se agitaron a intervalos de 15 minutos para tener una distribución uniforme del inóculo del virus. Después de 1 h, se agregaron 10 ml de medio completo a cada matraz y los matraces se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante 48 h a 72 h.

Después de la incubación, los matraces se analizaron bajo un microscopio de contraste de fases. Las células deben disociarse de la superficie y deben observarse células redondas en la mezcla si el proceso de propagación del virus tiene éxito. La mezcla se recogió en un tubo de 50 ml (número de producto 06-443-20, Fisher Scientific) y los tubos se sellaron utilizando una capa de parafilm. La suspensión en el tubo se centrifugó a ~2600 g durante 10 minutos usando una centrífuga con rotores oscilantes (número de producto 22500126, Fisher Scientific). El sobrenadante que contenía el virus se recogió del tubo y se reunió en un tubo nuevo. Después de mezclar suavemente el tubo para obtener una suspensión uniforme, la suspensión se distribuyó en alícuotas en viales criogénicos de 1 ml con junta tórica (número de producto 5000-1012, Fisher Scientific). Los tubos fueron etiquetados y almacenados en tanques de nitrógeno líquido.

Se preparó y mezcló bien aproximadamente un 4 % de agarosa (número de producto MP11AGR0050, Fisher Scientific) en agua de grado reactivo (número de producto 23-249-581, Fisher Scientific)48. Luego se repartieron alícuotas de la suspensión en las botellas de vidrio. La solución se esterilizó a 121 °C durante 15 min en un autoclave y se almacenaron alícuotas de 50 ml a 4 °C hasta su uso.

Uno de los tubos que contenía 50 ml de solución de agarosa estéril se calentó en un horno microondas durante aproximadamente 30 s. La solución se enfrió hasta 65 °C en un baño de agua. Se mezclaron aproximadamente 23,9 ml de medio EMEM con 0,6 ml de FBS y se calentaron a 50 °C. Se añadieron aproximadamente 3,5 ml de solución de agarosa a la mezcla de medio calentado usando una pipeta serológica de 10 ml y se mantuvo a 50 °C hasta su uso.

En primer lugar, las células adheridas al matraz se resuspendieron usando tripsina. La solución se mezcló suavemente para obtener una suspensión celular uniforme y se tomaron 10 µl de la suspensión para el recuento celular usando una cámara de hemocitómetro. Las células se contaron utilizando un microscopio de contraste de fases. Según el recuento de células, la concentración de células se ajustó a ~6,5 x 105 células por ml diluyendo la suspensión utilizando el medio completo. Se agregaron aproximadamente 6,5 x 105 células a cada pocillo de una nueva placa de seis pocillos (número de producto CLS5316, Corning). Luego, se agregaron 2 ml de medio completo a cada pocillo y la placa se almacenó a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h. A continuación, se comprobó la cobertura celular de cada pocillo bajo el microscopio. La cobertura celular debe alcanzar ~95% para realizar el ensayo de PFU.

Para una placa de seis pocillos determinada, las células de cada pocillo se infectaron con 100 µl de suspensión de virus diluida (los factores de dilución para VSV, HSV-1 y EMCV son 2−1 × 10−6, 2−2 × 10−5 y 2-3 × 10-3, respectivamente), y se agregaron a las células ~ 2,5-3 ml de la solución de superposición. Después de la solidificación del recubrimiento a temperatura ambiente, la placa se incubó en una incubadora (Heracell VIOS 160i CO2 Incubator, Thermo Scientific) durante 48 h, 120 h y 72 h correspondientes a VSV, HSV-1 y EMCV, respectivamente. En la figura complementaria 11 se muestra una comparación fotográfica de las muestras de HSV-1 a las 72 h, 96 h y 120 h de incubación, que confirma la necesidad de 120 h de incubación para las UFP de HSV-1. De manera similar, en la Figura complementaria 12 se muestra una comparación fotográfica de las muestras de EMCV a las 48 h y 72 h de incubación, lo que confirma la necesidad de 72 h de incubación para EMCV. Estas observaciones también están en línea con estudios previos43,44.

La preparación de las placas de 12 pocillos utilizadas para las pruebas VSV PFU siguió el mismo flujo de trabajo de la preparación de VSV en placas de seis pocillos. La única diferencia en la preparación de placas VSV de 12 pocillos es que las células sembradas en cada pocillo, el volumen de suspensión de virus por pocillo y la solución de recubrimiento de agarosa utilizada para cada pocillo se redujeron a la mitad en comparación con las placas de seis pocillos. Resumimos las diferentes configuraciones experimentales que se utilizaron para VSV, HSV-1 y EMCV en el proceso de propagación del virus y preparación de placas de pocillos en la Tabla complementaria 2.

Se mezclaron aproximadamente 0,1 g de polvo de cristal violeta (número de producto C581-25, Fisher Scientific) con 40 ml de agua de calidad para reactivo en un tubo de centrífuga de 50 ml. La mezcla se mezcló suavemente para disolver el polvo. Se añadieron aproximadamente 10 ml de metanol (número de producto A452-4, Fisher Scientific) a la mezcla, que luego se almacenó a temperatura ambiente.

Estos pasos solo se realizaron para compararlos con las lecturas de PFU de nuestro dispositivo. Después de 48 h de incubación de VSV, 120 h de incubación de HSV-1 o 72 h de incubación de EMCV, se retiró la placa de la incubadora y las células se fijaron con 0,5 ml de solución de metanol y ácido acético durante 30 minutos. Después de 30 minutos, los pocillos se lavaron suavemente con agua para eliminar la capa de agarosa. Se eliminó el exceso de agua y se añadió a cada pocillo 1 ml de solución de violeta cristal. La placa con cristal violeta se colocó en la incubadora con agitador y se mezcló a 100 rpm durante 30 min. Después de 30 minutos de incubación, se usó agua del grifo para eliminar el exceso de tinte de la placa y los residuos se recogieron en un vaso de precipitados grande. La placa se dejó secar en una campana extractora y se almacenó a temperatura ambiente, cubierta con papel de aluminio.

Se construyó una configuración automática de imágenes PFU sin lentes para capturar los hologramas en línea de las muestras. Esta configuración incluye: (1) un sistema de imágenes holográficas, (2) una plataforma de escaneo mecánico 2D, (3) un sistema de enfriamiento, (4) un circuito de control y (5) un programa de control automático. Se utilizaron tres diodos láser verdes (a 515 nm, ancho de banda de 2 nm, diámetro de emisión de 0,17 mm, Osram PLT5510) para una iluminación coherente, donde cada diodo láser ilumina dos pocillos en la misma columna de la placa de muestra de seis pocillos (vídeo complementario 1) . Los diodos láser fueron controlados por un controlador (TLC5916, Texas Instruments) y se montaron a ~16 cm de distancia de la muestra. Se colocó un sensor de imagen de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) (acA3800-14 µm, Basler AG, tamaño de píxel de 1,67 µm, campo de visión de 6,4 mm × 4,6 mm) ~5 mm debajo de la muestra, formando un sistema de imágenes holográficas sin lentes. Los cambios de fase en las regiones PFU se codificaron en los hologramas adquiridos.

Hay varios factores que afectan la resolución espacial del sistema de imágenes holográficas sin lentes, incluyendo (1) la coherencia espacial de la iluminación, (2) la coherencia temporal de la iluminación, (3) la distancia axial entre la apertura de la fuente y el plano de muestra (denominado z1) y la distancia del plano de muestra al sensor (z2) y (4) el tamaño de píxel del sensor de imagen. En cuanto a la fuente de iluminación por pocillo, utilizamos un diodo láser monomodo con un tamaño de núcleo de 9 µm, con z1 ≈ 16 cm entre el plano de la fuente y el plano de la muestra, lo que proporcionó suficiente coherencia espacial cubriendo todo el plano de la muestra por pocillo. . En cuanto a la longitud de coherencia temporal de nuestra fuente de iluminación, tenemos:

donde n es el índice de refracción y es igual a 1 en el aire, λ = 515 nm y Δλ = 2 nm, que es el ancho de banda del diodo láser. En consecuencia, podemos calcular la apertura numérica efectiva debido al límite de coherencia temporal de la luz de iluminación como (NAtemporal):

donde z2 ≈ 5 mm. Esta NA basada en la coherencia temporal es menor que la apertura numérica efectiva dictada por la distancia entre la muestra y el sensor y la extensión del plano del detector y, por lo tanto, el límite de resolución holográfica de nuestro sistema dictado por la coherencia temporal se puede aproximar como :

Como nuestro sistema de imágenes holográficas en chip tiene \({z_1}\gg {z_2}\), funciona con un aumento marginal unitario49, y el tamaño de píxel nativo (1,67 µm) en el plano del sensor también arroja su propio límite de resolución porque de la pixelación de los hologramas adquiridos, a menos que se utilicen enfoques de superresolución de píxeles50,51 (PSR) para reducir digitalmente el tamaño de píxel efectivo de cada cuadro holográfico. En este trabajo, no se utilizó PSR ya que nuestro dispositivo actúa como un detector de PFU al detectar los cambios espaciotemporales inducidos por eventos de replicación viral y, por lo tanto, no fue necesaria una reconstrucción de hologramas de alta resolución espacial (por ejemplo, <1–2 µm). De hecho, estas opciones de diseño también nos ayudaron a simplificar y acelerar sustancialmente el proceso de procesamiento de imágenes y eliminar la adquisición de datos innecesaria. Además, las variaciones numéricas espaciotemporales que podrían introducirse como resultado de los algoritmos PSR en función del tiempo de incubación podrían haber introducido desafíos técnicos para el aprendizaje de las redes neuronales del clasificador PFU, que es otra consideración de diseño que tuvimos además de la Simplificación de la adquisición, procesamiento y almacenamiento de datos holográficos.

El campo de visión del sensor de imagen CMOS es de ~0,3 cm2 y, por lo tanto, se necesita un escaneo mecánico para obtener imágenes de toda el área de una placa de seis pocillos. Se construyó una plataforma de escaneo utilizando un par de rieles de traslación lineal, un par de varillas de soporte lineal y cojinetes lineales. También se utilizaron piezas impresas tridimensionales para ayudar con la carcasa y las juntas. Se utilizaron dos motores paso a paso (número de producto 1124090, Kysan Electronics), impulsados ​​por dos chips controladores (DRV8834, Pololu), para permitir que el sensor CMOS realizara un movimiento horizontal 2D. Este sistema de bajo costo lleva el sensor CMOS que se mueve en un patrón rasterizado y genera imágenes de un total de 420 hologramas (21 horizontales y 20 verticales, con una superposición del 15 %) en aproximadamente 3 minutos para completar todo el escaneo de la muestra (video complementario 1).

El sensor CMOS seleccionado podría calentarse hasta >70 °C durante su funcionamiento, lo que podría perturbar el crecimiento de la muestra y vaporizar la capa de agarosa, especialmente en regiones que están cerca de la ubicación de estacionamiento del sensor entre escaneos holográficos sucesivos. Por lo tanto, se construyó un sistema de refrigeración mediante ventiladores (QYN1225BMG-A2, Qirssyn). También sellamos los lados de la muestra usando parafilm (número de producto 13-374-16, Fisher Scientific) y abrimos cuatro orificios en la cubierta superior para formar un sistema de ventilación suave, que es una solución económica y fácil de implementar para evitar secado de la muestra.

Se usó un microcontrolador (Arduino Micro, Arduino LLC) para controlar los dos chips controladores del motor paso a paso, el chip controlador de iluminación y un interruptor digital basado en transistor de efecto de campo (usado para encender y apagar el sensor CMOS). Todos estos chips, junto con el interruptor digital, los cables y los condensadores, estaban integrados en una placa de circuito impreso, alimentada por un adaptador de corriente de 6 V y 1 A conectado al enchufe de pared.

Se desarrolló un programa de control automático con una interfaz gráfica de usuario (Figura complementaria 13) utilizando el lenguaje de programación C++. Se puede utilizar para ajustar los parámetros de captura de imágenes (por ejemplo, tiempo de exposición, etc.) del sensor de imagen CMOS y comunicarse con el microcontrolador para encender y apagar aún más los diodos láser o el sensor CMOS y controlar el movimiento del escaneo mecánico. sistema.

Todos los componentes junto con sus precios unitarios también se resumen en la Tabla complementaria 1. El costo de las piezas de todo este sistema de imágenes es inferior a 880 dólares estadounidenses, sin incluir la computadora portátil. A mayores volúmenes de fabricación, este costo se puede reducir aún más.

Después de la adquisición de la imagen para cada intervalo de tiempo, los hologramas sin procesar se reconstruyeron primero utilizando el enfoque del espectro angular basado en la retropropagación49,52,53,54,55. La distancia precisa entre la muestra y el sensor se estimó en la región central de cada pozo utilizando un algoritmo de enfoque automático basado en la métrica de gradiente de Tamura56. Se utilizó la misma distancia entre la muestra y el sensor para todo el pozo, ya que el método basado en redes neuronales puede tolerar el desenfoque. Luego, el canal de fase de los hologramas reconstruidos se unió a la imagen FOV completa utilizando un método basado en correlación y combinación lineal32.

A partir del segundo intervalo de tiempo, se realizó un registro de imagen en dos pasos para compensar la baja precisión de la etapa de escaneo mecánico. Primero se realizó un registro de imagen basado en correlación de FOV completo y aproximado; luego se siguió un registro local de imágenes elásticas finas57. El impacto de este registro de imágenes en dos pasos se muestra en el vídeo complementario 2.

Primero, cada cuadro actual se apiló con los tres cuadros anteriores (que se muestran en la figura complementaria 14a), y se estimó una imagen de fondo (que se muestra en la figura complementaria 14b) mediante la descomposición de valores singulares58. Al restar esta imagen de fondo, se suprimieron las señales de las regiones estáticas (como se muestra en la figura complementaria 14c). Luego, al aplicar filtrado bilateral, las regiones PFU con características de alta frecuencia espacial se mejoraron aún más (como se muestra en la figura complementaria 14d).

Se recortaron manualmente un total de 93 parches de imágenes (256 × 256 píxeles) en regiones PFU y 93 parches de imágenes de regiones que no son PFU en tres experimentos. Cada píxel de estos parches de imagen se etiquetó como 1 para la región PFU y 0 para la región que no es PFU. Se entrenó un clasificador ingenuo de píxeles de Bayes utilizando este conjunto de datos, donde la métrica de gradiente de Tamura56 se calculó en escalas de muestreo descendente de 2×, 4×, 8×, 16× y 32× para que sirvan como características seleccionadas manualmente. El efecto de este clasificador se muestra en la figura complementaria 14e. Finalmente, al aplicar varias operaciones morfológicas (como cerrar imagen, rellenar imagen, etc.), las regiones PFU se ubican de manera aproximada (como se muestra en la figura complementaria 14f).

Aunque este algoritmo aproximado de localización de PFU todavía estaba sujeto a la detección de falsos positivos (que se muestra en la figura complementaria 14g), podría simplificar sustancialmente el esfuerzo necesario para completar el conjunto de datos de entrenamiento de la red. Además, aplicar este algoritmo a un pozo negativo ayudaría a delimitar los posibles falsos positivos durante el entrenamiento de la red (que se muestra en la figura complementaria 14h). Es importante tener en cuenta que este algoritmo de localización de PFU solo se usó para la generación de datos de entrenamiento y no se usó en la fase de prueba ciega ya que su función era agilizar el proceso de generación de datos de entrenamiento para que fuera más eficiente.

Los conjuntos de datos de entrenamiento de red utilizados en nuestro trabajo se generaron combinando el algoritmo de localización PFU aproximado con el etiquetado humano. Para obtener los conjuntos de datos de entrenamiento para VSV, se tomaron imágenes y procesaron 54 pocillos de entrenamiento de nueve placas de seis pocillos que contenían nueve pocillos de control negativo y 45 pocillos positivos (infectados por virus). Para el conjunto de datos de entrenamiento positivo, después del preprocesamiento de la imagen, se aplicó el algoritmo de localización PFU aproximado a las imágenes obtenidas a las 12 h de incubación. De los 45 pozos positivos, este proceso generó automáticamente 6930 candidatos VSV PFU. Luego, cada uno de estos candidatos fue examinado por cuatro expertos utilizando la interfaz gráfica de usuario personalizada que se muestra en la Figura complementaria 2. Sólo los candidatos de PFU confirmados por los cuatro expertos se mantuvieron en el conjunto de datos de entrenamiento positivo; Las PFU potencialmente perdidas no son una preocupación aquí, ya que se trata solo del conjunto de datos de entrenamiento. Al final, se conservaron 357 vídeos positivos de las UFP confirmadas y se completaron hasta 2594 vídeos mediante la realización de aumentos a lo largo del tiempo. Para el conjunto de datos de entrenamiento negativo, todos los videos negativos se completaron con los nueve pocillos de control negativo. Para mejorar la especificidad de la red, también se aplicó el algoritmo de localización PFU aproximado a las imágenes holográficas obtenidas a las 12 h de incubación. En este caso, todas las regiones PFU detectadas fueron falsos positivos, ya que procedían de los pocillos de control negativo. Sin embargo, dichas regiones podrían contener características espacio-temporales únicas que potencialmente confundirían a la red PFU y, por lo tanto, se mantuvieron en el conjunto de datos de entrenamiento negativo para proporcionar ejemplos de entrenamiento valiosos para nuestra red neuronal profunda. En total, mediante este proceso se encontraron 1169 videos de este tipo, y el conjunto de datos de entrenamiento negativo se aumenta aún más a 3028 videos mediante selección aleatoria de los pocillos de control negativo. Siguiendo el mismo método de generación de conjuntos de datos, se prepararon en consecuencia los conjuntos de datos de entrenamiento de HSV-1 y EMCV que se utilizaron para el aprendizaje por transferencia. El algoritmo de localización de PFU aproximado mencionado anteriormente se aplicó por primera vez a imágenes de fase holográfica de 72 h para HSV-1 y a imágenes de fase holográfica de 60 h para EMCV. Para el conjunto de datos de entrenamiento de HSV-1, se generaron 1058 videos positivos de 122 UFP de HSV-1 confirmadas de diez pozos y 1453 videos negativos de dos pozos de control negativos. De manera similar, 776 videos positivos de 152 UFP de EMCV de 15 pozos y 1875 videos negativos de tres pozos de control negativos formaron el conjunto de datos de entrenamiento para EMCV. Según la velocidad de formación de placas para cada tipo de virus, los intervalos de tiempo entre dos cuadros holográficos consecutivos para los videos VSV, videos HSV-1 y videos EMCV se establecieron en 1 h, 2 h y 1 h, respectivamente.

Nuestra red clasificadora PFU se construyó en base a la estructura DenseNet59, con capas de convolución 2D reemplazadas por bloques de construcción pseudo-3D60. La arquitectura detallada se muestra en la figura complementaria 15 y se describe en la nota complementaria 3. Utilizamos una unidad lineal rectificada como función de activación. En la capacitación se utilizó la normalización por lotes y la tasa de abandono con una tasa de 0,5. La función de pérdida que utilizamos fue la pérdida ponderada de entropía cruzada:

donde p es la salida de la red, que es la probabilidad de cada clase (es decir, PFU o no PFU) antes de la capa SoftMax, g es la etiqueta de verdad fundamental (que es igual a 0 o 1 para la clasificación binaria), K es el número total de muestras de entrenamiento en un lote y w es el peso asignado a cada clase, definido como w = 1 − d, donde d es el porcentaje de muestras en una clase (d = 46,1% para clase positiva, d = 53,9% para clase negativa).

Los videos de entrada de cuatro cuadros se formatearon como un tensor con una dimensión de 1 × 4 × 480 × 480 (canal × cuadro de tiempo × alto × ancho). Se aplicó el aumento de datos, como voltear y rotar, al cargar el conjunto de datos de entrenamiento. El modelo de red se optimizó utilizando el optimizador Adam con un coeficiente de impulso de (0,9, 0,999). La tasa de aprendizaje comenzó como 1 × 10−4 y se utilizó un programador para disminuir la tasa de aprendizaje con un coeficiente de 0,7 cada 30 épocas. Nuestro modelo fue entrenado durante 264 épocas utilizando la GPU Nvidia GeForce RTX3090 con un tamaño de lote de 30. La curva de pérdida, la sensibilidad del entrenamiento y las curvas de especificidad de nuestro proceso de entrenamiento se proporcionan en la Figura complementaria 16. En estas curvas, el 10% del conjunto de datos de entrenamiento fue seleccionado aleatoriamente como conjunto de datos de validación. Tenga en cuenta que los conjuntos de datos de entrenamiento y validación (que contienen videos holográficos de los pozos) se formaron a partir de varios pozos en diferentes momentos de cada ensayo de PFU como se detalló anteriormente; por lo tanto, estas curvas de sensibilidad y especificidad de entrenamiento y validación no reflejan la evaluación de un pozo de prueba individual que se monitorea periódicamente desde el inicio de la incubación. Sin embargo, los resultados de nuestras pruebas ciegas informados en 'Resultados' se adquirieron mediante el uso de la red neuronal de detección VSV PFU entrenada en pocillos de prueba individuales que fueron monitoreados continuamente desde el comienzo de la incubación con un período de muestreo de 1 h, logrando una detección >90 %. tasa de UFP de VSV con 100% de especificidad en <20 h.

De manera similar, construimos las redes neuronales de detección de PFU para HSV-1 y EMCV mediante aprendizaje por transferencia, donde se utilizó la misma arquitectura de red neuronal pero inicializada con los parámetros obtenidos por el modelo VSV previamente entrenado. Otras configuraciones de entrenamiento para los modelos HSV-1 y EMCV, como la función de pérdida, la tasa de aprendizaje inicial y el optimizador, se mantuvieron igual que el modelo VSV, pero la tasa de aprendizaje se redujo con un coeficiente de 0,8 cada diez épocas. Finalmente, los modelos HSV-1 y EMCV se obtuvieron después de 135 épocas y 88 épocas de entrenamiento, respectivamente, en función de la pérdida de validación.

Después de obtener el mapa de probabilidad de PFU y aplicar el umbral de 0,5, se siguieron dos pasos de posprocesamiento de imágenes para obtener el resultado final de detección de PFU: (1) proyección de probabilidad máxima a lo largo del tiempo y (2) umbral del tamaño de PFU. La proyección máxima se utilizó para compensar los valores más bajos de probabilidad de PFU generados por el centro de PFU cuando entra en la última etapa de su crecimiento. El efecto de esta proyección máxima se ilustra en la figura complementaria 17. El umbral de tamaño en el mapa de probabilidad de PFU se estableció en 0,5 × 0,5 mm2.

Después de obtener la máscara binaria de detección de UFP para cada pocillo de prueba, se desarrolló un algoritmo de recuento automatizado de UFP que es compatible con muestras virales densas y escasas. Primero, se encontraron los componentes conectados en la máscara de detección en la hora m (indicada como Dm). Luego, los recuentos de PFU para cada componente conectado en Dm se calcularon tomando el número máximo de componentes conectados que surgieron en esta región a lo largo del tiempo:

donde * denota la operación de multiplicación de elementos, ncc denota el recuento de PFU para el componente conectado examinado en Dm, Dt denota la máscara de detección de PFU en la hora t, C representa un mapa binario (con las mismas dimensiones que Dt), que solo mantiene el componente conectado actualmente examinado en Dm es 1, y H(·) se refiere a la operación de tomar el número de los componentes conectados. Finalmente, la suma del ncc para todos los componentes conectados en Dm se tomó como el recuento final de PFU para cada pocillo.

Para comparar con nuestro dispositivo, algunas de las placas de seis pocillos VSV se analizaron utilizando BioTek Cytation 5 (Agilent Technologies) en el modo de campo brillante con una lente objetivo de 4 ×, 0,13 NA. Estas imágenes capturadas se procesaron y analizaron utilizando su software autónomo Gen5 Image Prime (Agilent Technologies). Las imágenes locales capturadas se unieron primero en una imagen FOV completa de cada pocillo de prueba, que luego se procesó mediante la función de "contraste de fase digital" utilizando un tamaño de elemento estructurante de 50 μm. A continuación, se utilizó la herramienta de "análisis celular" para realizar el recuento automatizado de UFP. En su configuración básica, se utilizó un umbral de intensidad de 2500 y un umbral de tamaño de objeto de 1500 a 5000 µm. En su configuración de detección avanzada, el diámetro de la bola rodante para el aplanamiento del fondo, la intensidad del suavizado de la imagen y el nivel de fondo evaluado se establecieron en 1000 µm, 20 ciclos de filtro promedio de 3 × 3 y 30% de los píxeles más bajos, respectivamente. Todos los parámetros utilizados para el preprocesamiento y el recuento automatizado de PFU se optimizaron en consulta con el equipo de soporte técnico de Agilent Technologies.

Para evaluar el rendimiento de detección de PFU de nuestro dispositivo, la tasa de detección y la tasa de descubrimiento falso se definieron de la siguiente manera:

donde TP (verdaderos positivos) representa el número de PFU detectadas por nuestro dispositivo en un momento dado dentro de la incubadora y GT (verdadero terreno) es el número total de PFU contado por un experto para la misma muestra después de 48 h de incubación de VSV ( 120 h para HSV-1 y 72 h para EMCV) seguido de la tinción estándar como parte del protocolo de ensayo de placa tradicional. También utilizamos:

donde FP significa falsos positivos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los autores declaran que los datos principales que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el artículo y en su Información complementaria. Hay imágenes de prueba de ejemplo disponibles en https://doi.org/10.5281/zenodo.7931999. El conjunto completo de datos de imágenes sin procesar recopilados por el sensor (>11 TB) está disponible del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Los códigos PyTorch relacionados con el clasificador PFU están disponibles en https://github.com/liyuzhu1998/PFU_Detection_Codes. Los archivos CAD del dispositivo y sus instrucciones detalladas de montaje se pueden encontrar en https://github.com/liyuzhu1998/PFU_Detection_Hardware.

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Descargar referencias

El recuento de UFP basado en Agilent BioTek Cytation 5 se realizó en el Laboratorio de Investigación Traslacional de la Facultad de Farmacia de la Universidad del Sur de California. También agradecemos la ayuda del equipo de soporte técnico de Agilent para optimizar los parámetros utilizados para el procesamiento de imágenes y el recuento automatizado de PFU. El Grupo de Investigación Ozcan de UCLA agradece el apoyo de NSF (número de premio 2034234).

Estos autores contribuyeron igualmente: Tairan Liu, Yuzhu Li.

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Tairan Liu, Yuzhu Li, Hatice Ceylan Koydemir, Yijie Zhang, Ethan Yang, Merve Eryilmaz, Hongda Wang, Jingxi Li, Bijie Bai, Guangdong Ma y Aydogan Ozcan

Departamento de Bioingeniería, Universidad de California, Los Ángeles, EE.UU.

Tairan Liu, Yuzhu Li, Yijie Zhang, Merve Eryilmaz, Hongda Wang, Jingxi Li, Bijie Bai y Aydogan Ozcan

California NanoSystems Institute (CNSI), Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Tairan Liu, Yuzhu Li, Yijie Zhang, Hongda Wang, Jingxi Li, Bijie Bai y Aydogan Ozcan

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Texas A&M, College Station, TX, EE. UU.

Hatice Ceylan Koydemir

Centro de Tecnologías y Sistemas de Salud Remotos, Universidad Texas A&M, College Station, TX, EE. UU.

Hatice Ceylan Koydemir

Departamento de Matemáticas, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Ethan Yang

Facultad de Física, Universidad Xi'an Jiaotong, Xi'an, China

Guangdong Ma

Departamento de Cirugía, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Aydogan Ozcán

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AO concibió la investigación. YL, TL, HW y JL construyeron el sistema de imágenes sin lentes. YL, BB y HW desarrollaron el software de control del sistema. TL, HCK, YZ, ME e YL realizaron los experimentos. YL, TL, EY, GM e YZ procesaron los datos. TL, YL, HCK, YZ, EY y AO prepararon el manuscrito y todos los autores contribuyeron al manuscrito. AO supervisó la investigación.

Correspondencia a Aydogan Ozcan.

AO, YL y TL tienen una solicitud de patente pendiente (número de serie de EE. UU. 63/356,976) relacionada con el trabajo reportado en este manuscrito. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Biomedical Engineering agradece a Xueli Chen, Guohai Situ y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Notas complementarias, tablas y figuras.

Prototipo de imágenes holográficas durante su funcionamiento.

Impacto del proceso de registro de imágenes en dos pasos.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Liu, T., Li, Y., Koydemir, HC et al. Cuantificación rápida y sin manchas de la placa viral mediante holografía sin lentes y aprendizaje profundo. Nat. Biomédica. Ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01057-7

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Recibido: 04 de julio de 2022

Aceptado: 14 de mayo de 2023

Publicado: 22 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01057-7

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